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                肺癌免疫組化標志物檢測要點
                前言:為響應健康中國2030要求,推動全國腫瘤病理診斷能力提升、質量控制,由北京健康促進會發起并主辦的“星光生輝—腫瘤規范化病理示范活動”專題推文活動將于近期在91360智慧病理網旗下多個自媒體平臺發行舉辦?;顒右苑伟?、結直腸癌、乳腺癌、胃癌四大惡性腫瘤為重點開展,以基層腫瘤診療規范化建設、腫瘤診斷標準規范流程等內容進行專家專訪或解讀為主,通過詳細的學術分享以促進醫院腫瘤診療規范化及病理醫生腫瘤診斷能力提升。
                自2015年WHO肺癌分類將免疫組化(IHC)引入臨床病理分類模式以來, IHC在肺癌診斷中的重要性日益突出。除了區分小細胞癌和非小細胞癌(NSCC),患者選擇的治療方法與NSCC的組織學亞型直接相關,也與免疫組化結果有關,特別是對于低分化腫瘤。免疫組化的使用提高了肺癌分類的診斷準確性,但在某些情況下其鑒別仍然具有挑戰性。識別肺癌的不同組織學分型和預后因素對不同患者選擇最佳的個體化治療方案,判斷肺癌復發風險,具有極為重要的意義。結合Yasushi Yatabe等[1]在2019年發表的《肺癌免疫組化診斷的最佳實踐建議》并結合臨床實際,本期對免疫組化在肺癌診斷中應用的關鍵問題進行了闡述,有利于病理醫生在診斷中正確使用免疫組化標志物。
                肺癌免疫組化標志物檢測要點 
                   在過去十年中,免疫組織化學(IHC)領域取得了重大進展。染色技術的提高增加了敏感性和特異性。目前對肺癌患者的診斷,包括亞型的分型,以及靶向治療等都與之相關聯。因此,2015年WHO肺癌分類中首次將IHC引入分類模式,以反映肺癌的生物學特征,尤其是在小活檢/細胞學標本和分化不良的腫瘤中,免疫組化的作用更加重要。以下10個問題是臨床病理中經常碰到的問題,在此加以歸納和總結:
                1.日常診斷中最常用的免疫標記組合是什么?
                   當非小細胞癌(NSCC)需要免疫組化分型時,TTF1和p40是金標準,如果沒有神經內分泌分化(NE)的形態學特征,這兩個標記在臨床實踐中通常是足夠的。在鑒別鱗狀細胞癌方面,P40優于p63。
                圖1. ALK陽性的肺腺癌(A)。絕大多數ALK陽性肺癌的TTF1也呈陽性,如本例(B)。ALK陽性腫瘤的另一個特征包括p63(C)和p40(D)的不一致表達,當p63被單獨用作鱗狀細胞癌的標志物時,可能是一個陷阱。
                2. TTF1和p40的陽性界值是多少?
                TTF1的局灶陽性即可被認為是陽性,表明其為肺腺癌的可能性較高,而對于p40來說, 50%以上的腫瘤細胞核陽性才被認為是陽性。p40的局部/弱陽性不能診斷為鱗狀細胞癌。另一個重要的問題是關于TTF1和p40/p63雙陽性評價肺腺鱗癌的標準。首先,如果沒有手術切除標本就不能做出這種診斷,在小活檢中,如果有兩種不同的細胞群存在,就會產生這種可能性。相反,同一細胞中的雙陽性(TTF1和p40/p63)也不能定義腺鱗癌。研究顯示,這種腫瘤可能應該被歸類為NSCC,更傾向于腺癌。
                圖2. 一個TTF1灶性陽性的病例。組織學上,腫瘤細胞沒有顯示出明確的形態學分化(A)。顯示的TTF1染色(B)應被評價為陽性,因此該腫瘤被診斷為 "NSCC,傾向腺癌"。另一個病例也沒有明確的形態學分化(C)。由于p40的陽性反應的定義是腫瘤細胞的50%或更多的陽性染色,所以p40的散在陽性(D)不能做出鱗狀細胞癌的明確診斷(D)。
                3. 在肺腺癌中,TTF1不同克隆之間是否存在染色差異(SPT24, SP141 and 8G7G3/1)?
                   TTF1的染色特異性因克隆號的不同而不同。在最常用的抗體中,8G7G3/1是診斷肺腺癌最特異的抗體。TTF1染色有兩個重要作用:肺腺癌與鱗狀細胞癌的鑒別診斷,以及原發性肺腺癌與非肺癌的鑒別,大多數情況下對這兩者都具有特異性。然而,敏感性和特異性總是需要權衡的,在一些特殊類型的轉移性腫瘤中,TTF-1仍可陽性表達。因此,即使在肺TTF1陽性腺癌中,對于病理醫生來說,了解患者以前的腫瘤病史,特別是在形態特異的腫瘤中,尋找其他免疫組化標記物來確定其原發部位也是很重要的。
                圖3. 根據肺原發性鱗狀細胞癌的抗體克隆,TTF1的表達(A,H&E染色)??寺√朣PT24染色陽性(B)與克隆號8G7G3/1的弱或陰性表達(C)形成對比。
                4. CK7彌漫性陽性但TTF1和p40陰性的NSCC是否應被視為 "傾向是腺癌"?
                CK7對腺癌的診斷沒有特異性,這種標記在鱗狀細胞癌中也可陽性。因此不鼓勵在NSCC亞型中使用CK7。根據2015年WHO的分類,如果沒有支持腺癌或鱗狀細胞癌的形態學、粘蛋白染色或免疫組化標志物,在小的活檢標本中,腫瘤應歸類為NSCC,NOS。在沒有TTF1或p40表達的情況下,CK5/6和CK7單獨陽性時不能區分腺癌和鱗狀細胞癌。
                圖4.支氣管活檢標本中鱗狀細胞癌的細胞角蛋白表達(A)。p40(BC28 Ab)的核染色支持診斷(B)。細胞角蛋白7(OVTL12/30 Ab,C)和細胞角蛋白5/6(D5/16B4 Ab,D)均為陽性。
                5. 什么時候應將神經內分泌(NE)標記應用于非鱗狀細胞癌?
                NE標志物應僅用于有NE形態學表現時才能應用。目前WHO的分類建議只有在出現NE形態學特征(器官樣生長方式、緞帶樣結構等)時才應進行NE標記。大約10-30%的NSCC在光鏡下沒有明顯的NE形態,但可能會遇到NE標志物陽性的情況。此類腫瘤可被稱為“非小細胞癌伴NE分化”,但建議將手術切除的腫瘤主要分類為鱗狀細胞癌、腺癌或大細胞癌(如適用),并對NE標志物的陽性比例做出說明。由于缺乏一致的數據支持在沒有NE形態特征的情況下NE標志物陽性的臨床意義,因此不建議對缺乏NE形態的腫瘤進行NE標志物染色。
                6. 區分NE腫瘤與其他類型NSCC的最佳抗體組是什么?
                   嗜鉻粒蛋白A(Syn)、突觸素(CgA)和CD56是表達NE腫瘤的最佳組合。各抗體的染色意義因標本類型、組織學亞型及陽性反應的程度/強度而異。2015年WHO分類中給出了三種NE標記,包括嗜鉻粒蛋白A、突觸素和CD56。由于這些NE標記沒有明確的陽性截斷值,因此應結合形態學特征、樣本類型(細胞學、活檢或手術標本)和陽性反應程度進行判斷。最近研究表明,hASH1在生物學上被認為是NE細胞分化譜系的一個標記,并能特異性地對NE腫瘤進行染色。多克隆神經元特異性烯醇化酶(NSE)具有高靈敏度,但由于特異性低而不再使用。最近對胰島素瘤相關蛋白1(INSM1)的研究表明,這可能是對現有染色組合的一個理想補充,因為它對獨立起源于器官和組織學的神經內分泌腫瘤具有高特異性和敏感性。雖然不清楚加入INSM1是否能改善目前推薦的CGA、SYN和CD56檢測NE分化的總敏感性和特異性,但其核染色模式可能使判讀更加直接。
                圖5.肺類癌的典型免疫組化表達。注意腫瘤細胞的三個神經內分泌標志物均勻強染色和MIB1低表達。
                7. 什么時候應該使用細胞增殖指數進行診斷?
                   Ki-67在肺癌中的主要作用是幫助區分類癌和高級別NE癌(大細胞神經內分泌癌和小細胞癌),特別是在小的或破碎的活檢/細胞學樣本中。Ki-67在區分典型和非典型類癌中的作用尚未確定,需要更多的研究。有幾種Ki-67抗體可用于石蠟切片,但MIB-1克隆是抗原性修復后最廣泛使用的抗體。目前不建議用Ki-67來進行鑒別診斷。Ki-67并沒有被證明是一個不良的預后因素,盡管它在分化較差的腫瘤中往往會增加。根據組織學類型,預后的影響可能存在差異,其中增殖指數已被證明與腺癌的不良結果相關。然而,它可能與鱗狀細胞癌的預后不相關。一種新的標記物——抗磷酸組蛋白H3(PHH3)作為有絲分裂特異性標記物已經在各種類型的腫瘤中進行了研究,但缺乏對肺癌的大規模研究。
                圖6. 支氣管活檢常有擠壓的腫瘤細胞,如圖所示(A和C)。在這種情況下,如果是細胞學標本,Ki-67對診斷更有幫助,Ki-67染色(B和D)有助于類癌(A和B)和小細胞癌(C和D)的鑒別診斷。
                8. IHC對罕見肺癌亞型(肉瘤、唾液腺來源腫瘤和NUT癌)的鑒別診斷是否有用?
                   目前,需要通過IHC以及分子檢測來實現對罕見的肺癌進行明確診斷,并與形態相似的腫瘤進行區分。
                肉瘤樣癌
                     肺部的 "肉瘤樣癌"是一個總稱,包括梭形細胞癌、巨細胞癌和多形性癌(具有一個或多個常規癌成分的梭形/巨細胞癌),此外還有癌肉瘤和肺母細胞瘤。IHC的關鍵作用是將肉瘤樣癌與肉瘤樣間皮瘤、原發性或轉移性肉瘤(如腎臟)區分開來,并排除其他類型腫瘤,如轉移性黑色素瘤。角蛋白的表達在肉瘤樣癌中可能是相當多變的。在大多數情況下,其表達是極其微弱和局灶性的,在小的活檢標本中可能不明顯。腺樣和鱗狀細胞分化的標志物TTF1和p40在肉瘤樣癌中經常是陰性的,但在一部分病例中可能是陽性的。與肉瘤樣癌相似,肉瘤樣型間皮瘤對間皮標記物(WT1、Calretinin、D2-40)的表達通常為陰性或僅弱/局部陽性。盡管BAP1缺失通常有助于區分反應性間皮增生和惡性間皮瘤,但這種缺失發生在20%或更少的肉瘤樣型間皮瘤中,同時也可能發生在其他惡性腫瘤中,如肉瘤樣型RCC。癌變標志物的表達,包括Claudin-4、BER-EP4或B72.3,將支持肉瘤樣癌的診斷,而不是間皮瘤,但與角蛋白相似,這些標志物的表達可能極其微弱和局灶。最近,GATA3在肉瘤樣/蛻膜樣型間皮瘤中100%表達,因此缺乏GATA3的表達可以用來排除肉瘤樣型間皮瘤的診斷。值得注意的是,p16 FISH不能用于這種鑒別診斷,因為這兩種腫瘤都可能缺失。在許多情況下,免疫組化表達可能對于診斷用處不大,最終的診斷需要結合臨床-影像學信息和分子診斷結果。而角蛋白的局灶陽性不應作為支持肉瘤樣癌的唯一診斷標準,反之,角蛋白表達陰性,特別是在小樣本中,也不能傾向是肉瘤。
                唾液腺型腫瘤
                   唾液腺型癌可以出現在肺部;在這種情況下,必須首先排除唾液腺原發腫瘤的轉移。典型位置是支氣管周圍/支氣管內。最常見的原發性肺部唾液型腫瘤包括粘液表皮樣癌和腺樣囊性癌。中間細胞和鱗狀細胞中p40/p63表達,粘液染色的胞質內粘蛋白陽性,以及通過FISH顯示MAML2重排即可以支持粘液表皮癌的診斷。SOX10在粘液表皮癌中通常是陰性的。肺部的主要鑒別診斷是腺癌;如果腺體成分中TTF1/Napsin-A的表達會支持腺癌診斷,而MAML2重排則支持粘液表皮樣癌的診斷。對于腺樣囊性癌,主要的鑒別診斷是與肺基底樣鱗狀細胞癌和其他唾液型腫瘤。腺樣囊性癌表現為腔內上皮/肌上皮的雙重組成,腔內細胞標記為低分子量角蛋白和c-Kit陽性,而肌上皮細胞標記為p63/p40、SMA和S100陽性。此外,大多數腺樣囊性癌的IHC顯示為MYB陽性,并含有MYB融合。罕見的唾液腺型癌在肺部也有報道。包括上皮-肌上皮癌(p63/SMA/S100陽性的外層肌上皮細胞)、腺泡細胞癌(SOX10、DOG1陽性)、透明細胞癌(最近在頭頸部被重新命名為 "透明細胞癌"。p63/p40陽性,EWSR1融合),肌上皮癌(SOX10陽性,共同表達上皮標志物[角蛋白,EMA]+S100+多種肌源性標志物,p63,GFAP;EWSR1或FUS融合),以及與乳腺類似的分泌型癌(S100,乳球蛋白,GCDFP-15,SOX10,GATA-3,ETV6-NTRK3融合)。
                NUT癌
                睪丸核蛋白(NUT)癌是由15號染色體上存在的NUT基因重排所命名。一種高度特異性的NUT蛋白抗體已廣泛商品化,它在NUT癌中顯示出獨特的斑點狀核陽性。唯一能標記NUT的其他腫瘤是生殖細胞腫瘤,特別是精原細胞瘤;然而,它們的陽性通常是局灶性的,缺乏斑點狀模式。值得注意的是,NUT癌可能有CD34陽性,這在與白血病浸潤的鑒別診斷中很重要。其他鑒別診斷包括SWI/SNF染色質重塑因子缺陷的癌或肉瘤,它也顯示出上皮樣細胞的實體生長模式,往往部分具有橫紋肌樣特征。在一些報道中,這種腫瘤被報道為SMARCA4或SMARCB1缺失的癌或肉瘤。由于這類腫瘤是最近才被認識的,在目前的分類中還沒有明確這類腫瘤的分類。
                圖7.NUT癌典型H&E表現:未分化的、原始的、具有局灶驟然角化的形態特征(A)。NUT蛋白免疫組化顯示彌漫性核陽性,具有斑片狀表達(B)。
                9. 細胞學樣本的中的哪種類型樣本最適合進行免疫染色:細胞塊、風干的涂片還是乙醇固定的涂片?去除染色的涂片可以被使用嗎?
                   所有的細胞學樣本,包括細胞塊、乙醇固定的和風干的玻片,都可用于免疫染色。福爾馬林固定的細胞塊是最簡單的,但在細胞學免疫染色中需要嚴格的方案優化、驗證和質量控制。
                圖8.細胞學標本的免疫組化染色。(A)細胞塊標本中的TTF1陽性的腺癌(Ventana Benchmark XT免疫染色儀),對巴氏染色、乙醇固定、非細胞蠟塊的免疫組化染色(Leica Bond自動免疫染色儀)。(B)TTF1陽性的腺癌(通過紅色3-氨基-9乙基咔唑檢測),(C)p40陽性的非角化鱗狀細胞癌,(D)p40陽性的良性增生性的基底細胞(支氣管刷細胞學),(E)CD56陽性小細胞癌與相應的巴氏染色標本(F)
                10. 建議用哪些免疫組化套餐來區分肺的粘液腺癌和轉移性癌:
                目前還沒有有用的標志物來區分肺黏液腺癌和轉移性粘液腺癌。臨床病史對于這類腫瘤的診斷至關重要。大多數肺浸潤性粘液腺癌和其他具有粘液特征的肺腺癌,特別是缺乏TTF1表達的肺腺癌,HNF4α可以陽性。然而,HNF4α是原發腸道的分化轉錄因子,包括肝膽和消化道,都普遍表達這種轉錄因子。因此,HNF4α將無助于區分肺粘液腺癌和消化道及胰腺原發的粘液腺癌。在其他轉移性粘液腺癌中,乳腺和卵巢原發的粘液腺癌可以通過其特定的標記物與肺部原發癌區分開來,包括乳腺的標記物GATA3和ER,卵巢的標記物PAX8。盡管文獻中的結果令人滿意,然而,實際情況下不能依賴這些標記物,因為不是所有的轉移性腫瘤都是這些標記物的陽性。只有40%的卵巢粘液性腫瘤表達PAX8,表明這些抗體的鑒別診斷的敏感性很低。
                圖9. 轉移性肺癌的一些比較常見的鑒別診斷抗體和陷阱。子宮的轉移性漿液性腺癌的PAX8(單克?。╆栃裕ˋ)。原發性肺腺癌中的局灶性ER陽性(B)。乳腺轉移性腺癌的GATA3陽性(C)。肺部唾液腺型腺癌(粘液表皮細胞癌)的MGB1表達(D)。
                   我們選擇了10個關于IHC的關鍵問題,與目前的臨床病理實踐最為相關。IHC現在是診斷病理學不可缺少的工具,但也有很多陷阱。因此,形態學應作為我們病理診斷的基礎,上述所有建議只有在適當的臨床背景下才有效。特別是,病理醫生應該記住,臨床病史,包括年齡、性別、吸煙狀況,也提供了重要的診斷線索。在未來幾年,新技術的發展和新抗體的出現可能會改變目前的診斷情況。與預測性生物標志物檢測情況類似,診斷性IHC也與患者的治療選擇直接相關,因此臨床及病理醫生應確保所有患者在IHC的幫助下得到適當的診斷和治療。
                參考文獻:
                1. Yasushi Yatabe, Sanja Dacic, , Alain C. Borczuk, et al. Best Practices Recommendations for Diagnostic Immunohistochemistry in Lung Cancer, J Thorac Oncol. 2019, 14(3): 377–407
                 

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