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                非小細胞癌PD-L1免疫組化規范化流程
                前言:為響應健康中國2030要求,推動全國腫瘤病理診斷能力提升、質量控制,由北京健康促進會發起并主辦的“星光生輝—腫瘤規范化病理示范活動”專題推文活動將于近期在91360智慧病理網旗下多個自媒體平臺發行舉辦?;顒右苑伟?、結直腸癌、乳腺癌、胃癌四大惡性腫瘤為重點開展,以基層腫瘤診療規范化建設、腫瘤診斷標準規范流程等內容進行專家專訪或解讀為主,通過詳細的學術分享以促進醫院腫瘤診療規范化及病理醫生腫瘤診斷能力提升。
                針對PD-L1的免疫治療已被公認為是治療非小細胞肺癌和黑色素瘤的有效方法。隨著臨床實驗不斷顯示出PD-1/PD-L1檢查點抑制劑對各種實體瘤患者的療效,獲批的適應癥清單正在迅速增加。臨床實驗采用了各種PD-L1免疫組化檢測方法,評估PD-L1在腫瘤細胞、免疫細胞或兩者上的表達,作為預測免疫療法反應的潛在生物標志物。病理醫生要求進行PD-L1檢測以指導治療的選擇,正迅速成為普遍現象。因此,病理醫生需要了解不同的PD-L1檢測方法、不同類型腫瘤的評估方法以及檢測結果對治療決策的影響。本期綜述討論了與在病理實驗室進行的PD-L1檢測相關的關鍵問題,包括PD-L1檢測的標本、影響因素、PD-L1抗體克隆和染色平臺的選擇、PD-L1的評分標準和判讀。
                非小細胞癌PD-L1免疫組化規范化流程
                  針對PD-L1的免疫治療已被納入多種實體瘤的治療指南中,特別是非小細胞肺癌已作為一線治療方案被廣泛使用。腫瘤細胞和腫瘤浸潤免疫細胞上的PD-L1表達可通過福爾馬林固定、石蠟包埋(FFPE)組織的免疫組化(IHC)進行檢測。在一些國家,對于某些適應癥,在評價ICI之前,必須通過IHC檢測PD-L1。2021年,Elizabeth等[1]在《PD-L1作為實體腫瘤免疫治療的預測標記物:其免疫組化檢測指南》(下稱《指南》)中指出:在美國、歐洲、加拿大和日本,將pembrolizumab作為NSCLC的一線單藥治療的處方,需要證明至少50%的腫瘤細胞上有PD-L1染色。在澳大利亞,pembrolizumab單藥(一線或二線)的產品信息規定,患者腫瘤的PD-L1腫瘤比例得分(TPS)至少為1%,治療指南推薦PD-L1 TPS 50%且缺乏EGFR、ALK或ROS1改變的患者使用pembrolizumab單藥。由于存在不同的PD-L1克隆、染色平臺、評分方法和不同藥物和腫瘤的評分閾值,實施和解釋PD-L1 IHC對病理學家來說是一個挑戰。
                  在組織樣本或細胞學樣本提取時,如果要確認腫瘤細胞存在,采樣評價內容包括 :細胞組成、腫瘤細胞的數量 ,是否按照要求進行處理與運輸。評價方法包括肉眼觀察、顯微鏡下和濃度分析等。腫瘤組織切片等應經病理醫師審閱,取一張切片 HE 染色后顯微鏡下觀察,確保腫瘤細胞存在,并記錄腫瘤組織含量 ,標注腫瘤細胞密集區域。
                  對于石蠟包埋組織中(FFPE)的樣品收集需注意:10%中性福爾馬林固定手術切除樣本,按病理學操作規范進行取材。制作石蠟切片時,切取5片連續切片,其中1片進行HE染色,確認腫瘤細胞的含量?!吨改稀分兄赋?,目前有一系列用于PD-L1檢測的IHC檢測方法,已被美國食品和藥物管理局(FDA)批準,并可作為 “輔助診斷 ”用于FFPE組織,以確定用以從PD-1/PD-L1獲益的患者。在現有的臨床實驗中,這些檢測方法大多被開發為特定藥物的潛在生物標志物,并使用特定的PD-L1克隆、染色平臺和PD-L1表達評分方法。
                  許多因素影響免疫組化染色的敏感性和特異性。這些因素包括標本的處理,如標本的類型、組織固定和處理,以及表達內在異質性;分析因素,如使用的克隆號或檢測方法的質控;以及檢測后的因素,如使用的評分方法、觀察者之間的差異和特定培訓的作用。
                  標本的處理:可能影響IHC結果的標本處理因素包括冷缺血時間(組織切除和浸泡在固定液中的時間)、所用固定液的數量和類型以及固定時間、儲存條件和未染色切片存儲時間。組織固定:理想情況下,應使用10%的中性緩沖福爾馬林進行固定。有一些證據表明,非福爾馬林類固定液,包括含有酒精的固定劑(如酒精福爾馬林醋酸、Prefer固定劑和CytoLyt)可能會導致明顯的差異,如PD-L1的染色缺失。標本應被固定在足夠體積的中性緩沖福爾馬林中,固定液與組織的比例至少為10:1,但商用PD-L1抗體廠家建議的比例為15:1至20:1。標本應在手術后30-60分鐘內放入固定液中,有證據表明,如果離體時間過長,PD-L1的膜陽性表達可能會減少。為了獲得最佳的IHC結果,標本應至少固定6小時至72小時。過度固定似乎不會對PD-L1的IHC表達產生影響。
                  脫鈣:對于包括骨化或鈣化區域的腫瘤,特別是對于轉移性和復發性腫瘤,至少取一個沒有脫鈣的腫瘤塊,因為這些組織可能需要進行各種免疫組化和DNA檢測,以幫助診斷或指導治療,而脫鈣會影響這項檢測。當不能避免脫鈣時,建議使用EDTA或甲酸進行“溫和”脫鈣,因為這些方法往往能更好地保存抗原。雖然與臨床實驗相關的IHC檢測尚未對脫鈣組織進行明確驗證,但有證據表明EDTA和甲酸脫鈣對使用22C3檢測的PD-L1表達影響很小。而更強的脫鈣液,例如鹽酸類脫鈣劑,隨著脫鈣時間的延長,其染色強度會逐漸降低,因此應避免使用。
                  切片和染色:組織切片在4-5毫米,并平鋪在帶正電荷的玻片上。載玻片應在60℃下烘烤60分鐘,或在37℃下過夜。PD-L1 IHC最好在新切的切片或不到2個月的未染色切片上進行,以避免潛在的染色丟失。蠟塊時間過長也可能使得PD-L1的表達減少,應盡可能避免使用超過12個月的組織蠟塊。
                  標本的選擇:PD-L1在腫瘤內(腫瘤內異質性)以及原發和轉移部位之間(腫瘤間異質性)都可能有所不同。在切除標本中,單個蠟塊的染色可能會準確反映整個腫瘤的PD-L1表達。
                  而決定治療的通常是一個小的活檢樣本中PD-L1的表達水平,這可能是一個重要的問題,因為活檢有可能不能代表整個腫瘤的情況。然而,這些可能是某些患者唯一可用的樣本。事實上,活檢是臨床實驗評估的一部分,為我們目前的臨床實踐提供參考。對原發性和轉移性樣本之間的腫瘤異質性也進行了研究,對不同的腫瘤有不同程度的意見。在尿路上皮癌中,如果有的話,建議使用轉移的活檢組織。在NSCLC中,目前沒有統一的數據來推薦選擇轉移性或原發腫瘤,兩種樣本都可以使用。鑒于PD-L1表達的可變性,它可以被新輔助化療和腫瘤微環境相關因素所改變,一般來說,謹慎使用治療后的標本。
                  22C3 pharmDx檢測 :PD-L1 IHC 22C3(安捷倫公司,Dako公司)是一種用于可pembrolizumab治療的診斷性檢測,使用單克隆小鼠抗PD-L1抗體。該測試建議在EnVision FLEX可視化系統并在Dako Autostainer Link上進行。載玻片上所有存活的腫瘤細胞都必須納入評分評估中。
                  28-8 pharmDx檢測:PD-L1 IHC 28-8 pharmDx(安捷倫,Dako)使用單克隆兔抗PD-L1抗體(克隆28-8),并已被批準作為nivolumab治療的補充診斷。它需要在Dako Autostainer Link平臺上使用。
                  SP142檢測 :Ventana PD-L1 (SP142)檢測使用單克隆兔抗PD-L1抗體(克隆號SP142),并被批準作為atezolizumab的診斷性檢測。建議在Ventana BenchMark Ultra平臺上使用。
                  SP263檢測 :Ventana PD-L1 (SP263)檢測使用單克隆兔抗PD-L1抗體(克隆號SP263),被批準作為診斷性檢測,用于pembrolizumab、durvalumab和nivolumab治療NSCLC,以及用durvalumab治療尿路上皮癌。建議在Ventana BenchMark Ultra平臺上使用。
                  73-10檢測:PD-L1 IHC 73-10檢測使用單克隆兔抗PD-L1抗體(克隆73-10)。它是由Dako公司開發的,作為用以Avelumab臨床試驗的診斷性測試,目前僅用于研究。
                  E1L3N技術公司的E1L3N抗體克隆是一種市售的IHC抗體,它與特定的染色平臺沒有聯系,可作為實驗室開發的測試進行優化。
                  PD-L1 IHC的判讀:
                  各種臨床實驗對不同類型的腫瘤采用了不同的評分標準和不同PD-L1免疫組化檢測的判讀方法。多數建議對PD-L1的評估應在有活性的浸潤性惡性腫瘤區域進行,正常細胞和原位成分不應包括在評估中。至少要有100個存活的腫瘤細胞,判讀才算可靠(圖1)。當可用于判讀的組織有限時,這些判讀標準在細胞蠟塊和活檢活檢中尤為重要。
                 
                圖1.肺腺癌細針抽吸細胞蠟塊中的腫瘤比例得分。(A) 評估需要至少100個惡性細胞(H&E,40×);插圖顯示腺癌(H&E,200×)。(B) 該切片中腫瘤比例評分為80%(SP263,40×);插圖顯示惡性細胞的膜染色陽性(SP263,200×)。
                腫瘤細胞的染色:所有PD-L1的染色都顯示為腫瘤細胞的膜染色(圖2A,B)。在評分時,任何強度的膜染色陽性都應被視為陽性。腫瘤細胞的細胞質和核染色不應視為陽性,應忽略不計。
                圖2.PD-L1免疫染色的判讀。(A) 腫瘤細胞中任何強度的膜染色都應被評估。腫瘤相關的炎癥細胞表現出顆粒狀染色模式(藍色矩形)(22C3 IHC)。 B)轉移到肝臟的口腔鱗狀細胞癌(H&E)。
                炎癥細胞的染色:只有浸潤在浸潤性腫瘤及其相關的瘤內和瘤周間質中的免疫細胞才應被用于評分。作為一個粗略的指導原則,炎癥細胞應出現在與侵襲性腫瘤相同的高倍視野(40×)內。一般來說,炎癥細胞往往比腫瘤細胞小,并顯示點狀或顆粒狀的染色,而不是腫瘤細胞中的線狀膜染色(圖2A,B)。這種區別對于只評估免疫浸潤染色的腫瘤來說可能很重要。免疫細胞(通常是巨噬細胞,偶爾也有樹突狀細胞或淋巴細胞)在任何可識別的PD-L1染色中被認為是陽性的,無論免疫細胞的類型或定位。漿細胞、血管內中性粒細胞和中性粒細胞碎片不應包括在內。
                評分方法:現已提出多種評分方法來量化不同惡性腫瘤的PD-L1表達,評估腫瘤細胞或炎癥細胞或兩者的染色。所有的判讀都應在具有最高數量的存活腫瘤細胞的切片上進行。應避免壞死、出血和電刀燒灼區域。
                腫瘤比例評分(TPS):TPS是指相對于標本中存在的活性腫瘤細胞總數而言,顯示出任何強度的部分或完全膜染色的活性腫瘤細胞的百分比(圖3A,B)。非腫瘤細胞及免疫細胞,如浸潤的淋巴細胞或巨噬細胞也可能被PD-L1染色(圖3C,D);但是,這些細胞不應包括在PD-L1的陽性評分中。這種測定方法適用于NSCLC,使用22C3 pharmDx測定(或同等方法)來評估是否可以應用pembrolizumab。
                TPS (%)= 陽性腫瘤細胞/腫瘤細胞總數×100
                圖3.(A) 肺腺癌(H&E)。(B)用PD-L1(克隆號SP263)進行免疫組化染色,顯示大約70%的腫瘤細胞被染色,腫瘤比例評分(TPS)為70%(B)SP263 20×。插圖顯示惡性細胞中的膜染色陽性(SP263;200×)。(C) 肺腺癌,大量的巨噬細胞(H&E)。(D) 肺部巨噬細胞中僅有PD-L1免疫染色,只有不到1%的腫瘤細胞顯示弱的膜染色,TPS<1%(SP263)。與H&E染色的切片對比,有助于識別巨噬細胞,并在評估NSCLC的TPS時將其排除。
                   綜合陽性評分(CPS) CPS的計算方法是將存活的PD-L1陽性腫瘤細胞數與陽性免疫細胞(淋巴細胞和巨噬細胞)數相加,然后除以存活的腫瘤細胞總數(圖4),最高分定義為100。這種方法被建議用于頭頸部SCC、尿路上皮癌以及胃和胃-食管交界處腫瘤的22C3 pharmDx檢測的免疫組化染色。
                CPS=陽性腫瘤細胞+陽性浸潤性免疫細胞/總的腫瘤細胞數×100
                圖4.(A) 口腔鱗狀細胞癌(H&E)。(B) 腫瘤細胞中任何強度的PD-L1膜染色和腫瘤相關炎癥細胞中的顆粒狀染色,CPS達到40-50(22C3)。
                  免疫細胞(IC)評分 IC評分只考慮浸潤腫瘤的免疫細胞,包括淋巴細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和粒細胞(圖5)。惡性腫瘤細胞也可能是陽性的,但不包括在評分中。任何明確的PD-L1染色,無論免疫細胞的類型或定位,都被視為陽性。它表示免疫細胞占據總的腫瘤面積的百分比,包括陽性免疫細胞在腫瘤內和腫瘤周圍間質。在等待TGA批準之前,建議用SP142免疫染色法評估atezolizumab治療
                IC (%)=浸潤性免疫細胞在腫瘤成分中的面積/腫瘤及周圍間質的總面積×100
                圖5.(A) 乳腺轉移性三陰性浸潤性導管癌(H&E)。(B) 腫瘤相關炎癥細胞的PD-L1顆粒狀染色,免疫細胞(IC)評分為2%。腫瘤細胞中的染色不包括在評估中(SP142)。
                   腫瘤細胞(TC)和免疫細胞面積(IC-Area)評分 這種評分方法是基于對腫瘤細胞(TC)和免疫細胞(IC-Area評分)的單獨評分。IC是指陽性免疫細胞所占的面積,以占所有腫瘤相關免疫細胞所占總面積的比例表示(圖6A,B)。TC是指表達PD-L1的腫瘤細胞占腫瘤細胞總數的比例(圖6C,D)。TC或IC-Area得分必須超過截斷值才能被認為是 "陽性";這兩個分數不能相加。這種評分方法已被建議用于SP263檢測指導durvalumab治療尿路上皮癌。
                TC(%)= 陽性腫瘤細胞/腫瘤細胞總數×100
                IC-Area(%)=陽性免疫細胞所占的面積/腫瘤相關免疫細胞所占的總面積×100
                圖6 (A) 侵及固有肌層的高級別尿路上皮癌(H&E)。(B) 炎癥細胞的PD-L1免疫染色,免疫細胞(IC)評分為80(SP263)。(C) 另一個侵及固有肌層的高級別尿路上皮癌(H&E)。(D) 腫瘤細胞的膜性PD-L1免疫染色,TC評分為30(SP263)。
                參考文獻:
                1.ELIZABETH C. PAVER,WENDY A. COOPER,ANDREW J. COLEBATCH,et al. Programmed death ligand-1 (PD-L1) as a predictive marker for immunotherapy in solid tumours: a guide to immunohistochemistry implementation and interpretation. Pathology,2021, 53(2):141–156

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