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                基因異常檢測方法及其在非小細胞肺癌的應用
                前言:為響應健康中國2030要求,推動全國腫瘤病理診斷能力提升、質量控制,由北京健康促進會發起并主辦的“星光生輝—腫瘤規范化病理示范活動”專題推文活動將于近期在91360智慧病理網旗下多個自媒體平臺發行舉辦?;顒右苑伟?、結直腸癌、乳腺癌、胃癌四大惡性腫瘤為重點開展,以基層腫瘤診療規范化建設、腫瘤診斷標準規范流程等內容進行專家專訪或解讀為主,通過詳細的學術分享以促進醫院腫瘤診療規范化及病理醫生腫瘤診斷能力提升。
                近十年來,晚期非小細胞肺癌的治療,尤其是靶向治療,取得了極大的進展,分子分型是非小細胞肺癌實施靶向治療的前提。目前,選擇準確、快速、恰當的檢測方法,全面篩選出適用的靶向藥物的目標人群具有重要意義。本文就在非小細胞肺癌常見的基因異常表現及檢測方法做一闡述,以期在臨床病理檢測中選擇最優方法,使患者獲益。
                  NCCN指南推薦晚期非小細胞肺癌(NSCLC)患者常見的基因異常類型為基因突變、基因過表達、基因融合等。一般情況下都應當進行腫瘤組織或脫落癌細胞的EGFR、ALK突變檢測,以明確靶向藥物的敏感位點和可能存在的耐藥情況。對EGFR和ALK突變陰性的NSCLC患者可嘗試進行ROS-1、c-MET、RET、KRAS及BRAF的基因檢測[1]。
                  在NSCLC中,常見的基因改變類型有:1.EGFR基因變異類型:EGFR基因變異包括基因突變(點突變、插入/缺失突變),主要發生在編碼EGFR酪氨酸激酶區的第18~21號外顯子,以及獲得性耐藥突變(包括第一、二代TKI 的耐藥突變T790M 和第三代TKI 的耐藥突變C797S 等)。EGFR 基因擴增對選擇TKI 治療目前無明確臨床意義。2. ALK基因變異類型:ALK基因變異類型包括基因重排/融合,以及獲得性耐藥突變(點突變為主)。目前至少發現了20 多種EML4-ALK 融合變異亞型。此外還有更多少見/罕見的ALK融合伴侶不斷被發現。3. ROS1 基因變異類型:ROS1 基因變異包括ROS1基因重排。目前共發現十余種ROS1基因融合伴侶,主要包括CD74、SLC34A2、CCDC6、TPM3、EZR等,其斷裂位點主要位于ROS1基因的第32~36號外顯子。5.MET 基因變異類型:在NSCLC 的臨床實踐中,根據已有的循證醫學證據,目前主要關注MET第14號外顯子跳躍突變和MET擴增的檢測。6. 除此以外,HER2、BRAF、KRAS、RET、NTRK等:除了上述靶分子外,HER2基因突變或擴增、BRAF突變、KRAS 突變、RET 基因重排、NTRK 家族基因重排等,均為NSCLC中重要的驅動基因變異,并是潛在的治療靶點。7. PD-L1表達檢測:通過IHC檢測腫瘤細胞和/或免疫細胞PD-L1的表達水平是目前判斷NSCLC患者能否從免疫檢查點抑制劑治療中得到更多獲益的主要評估手段。
                  針對不同的突變類型,臨床中需用到不同的檢測方法,以獲得最精準的結果。常用分子病理檢測方法主要特點比較見表1。常見的基因改變檢測方法:1)點突變、插入/缺失:主要是EGFR L858R、EGFR-19del、EGFR T70M和EGFR-E20ins,是基于DNA水平上的改變,臨床上常用的檢測方法有ARMS-PCR、NGS、dPCR等。主要包括EGFR最主要的突變位點外顯子19缺失(19del)和外顯子21點突變(L858R),同時還包括外顯子18點突變(G719X),外顯子20插入突變(20ins)和點突變(T790M、S768I),外顯子21 點突變(L861Q)等。對于這些已知突變,組織樣本推薦采用ARMS-PCR法,檢測時間短且檢測費用相對較低?;趒RT-PCR 的方法,需要根據EGFR基因已知的突變類型設計引物探針,無法檢測出所有可能的突變,但靈敏度相對較高,操作簡單,無需對PCR產物進行操作,在很大程度上避免了擴增產物的污染,易于在臨床開展,是目前EGFR 基因突變檢測最常用的檢測技術之一。二代測序是一種高通量測序技術,能夠同時對多基因、多位點進行測序。二代測序檢測EGFR基因突變,檢測位點更加全面,可以發現罕見突變位點,為晚期NSCLC患者的全流程管理提供依據。2)基因重排/融合:涉及到的基因主要由ALK、ROS1、RET等,可以采用的檢測方法有免疫組化、FISH、ARMS-PCR和NGS。ALK Ventana D5F3 IHC檢測方法是目前最快速、經濟的方法。該判讀標準僅適用于肺腺癌,該檢測在用于鱗癌、神經內分泌癌等其他類型肺癌標本時應謹慎,疑似陽性標本需要使用其他方法進行驗證。FISH檢測是檢測ALK重排的“金標準”,檢測結果判讀直觀,對樣本質量要求較低,但費用較高、經濟效益比不佳。并且在FISH判讀時,對于處于臨界值分離信號、不典型分離信號等的判定需要格外謹慎,推薦利用其他技術平臺復核檢測?;趒RT-PCR方法的ALK融合基因檢測具有較高的靈敏度和特異度,但因為qRT-PCR 只能檢測已知ALK 融合基因類型,所以存在假陰性。另外,由于qRT-PCR基于mRNA擴增技術,因此實驗室內、外部質控等應制定最嚴格的技術標準,防止污染。二代測序對ALK基因融合通過捕獲平臺在DNA/RNA水平或擴增子平臺在RNA水平上進行檢測。但對于質控不合格或結果不典型病例,報告時應加備注,并建議使用其他技術平臺進行復檢。同時當二代測序在血液中檢出ALK基因變異時,應注意假陰性結果的出現。3)基因重排:ROS1基因重排/融合表達檢測各種方法學與ALK 相似,但IHC抗體特異性不佳,目前不能直接用于檢測ROS1基因重排/融合表達,僅可用于ROS1基因融合初篩?;趒RT-PCR方法的ROS1融合基因檢測具有較高的靈敏度和特異度,且可與ALK聯檢。FISH檢測是檢測ROS1重排的“金標準”。二代測序檢測ROS1基因變異同樣可在DNA水平上檢測重排序列,也可在mRNA水平檢測融合序列,但由于ROS1基因序列的特殊性,基于DNA水平的二代測序檢測靈敏度受文庫探針設計及生物信息學分析能力影響較大,應注意假陰性。4)跳讀突變:MET第14號外顯子跳躍突變的檢測,包括二代測序或qRT-PCR直接檢測缺失MET第14號外顯子的mRNA,或二代測序在DNA 水平上檢測可能導致MET第14號外顯子剪切的基因變異。MET 基因探針覆蓋范圍不夠可能導致基于DNA的二代測序發生漏檢,建議二代測序檢測應盡量涵蓋第14號外顯子外的如第13或14號內含子上可能發生剪切變異的區域。原位雜交檢測是檢測MET擴增的標準方法。相較于FISH,二代測序可用于MET擴增檢測,但與FISH檢測的對應性比較復雜,并可能遺漏MET多體,但是二代測序可同時檢測MET突變和融合等其他變異,且能實現多基因共檢,在臨床實踐中應用更廣。5)蛋白過表達:NSCLC中蛋白過表達可用于指導臨床靶向治療的基因有HER2、NTRK和PD-L1,通過IHC檢測腫瘤細胞和/或免疫細胞PD-L1的表達水平是目前判斷NSCLC患者能否從免疫檢查點抑制劑治療中得到更多獲益的主要評估手段。目前我國已批準3種標準化的PD-L1檢測商用試劑盒用于臨床檢測,包括配套Dako平臺的PD-L1 IHC 22C3 pharmDx試劑盒及濃縮液、PD-L1 IHC 28-8 pharmDx 試劑盒以及配套Ventana檢測平臺SP263試劑盒。不同單抗和IHC染色平臺的使用、PD-L1染色陽性截斷值的設定與相應的免疫治療藥物療效相關。PD-L1 檢測所用抗體克隆不同其陽性閾值不同。除了上述靶分子外,HER2基因突變或擴增、BRAF突變、KRAS 突變、RET 基因重排、NTRK 家族基因重排等的檢測方法可參照基因點突變、基因重排類型的檢測方法和檢測策略,更多的尚需臨床實踐的積累。
                表1 非小細胞肺癌常用分子病理檢測方法主要特點比較
                參考文獻:1. 中華醫學會病理學分會, 國家病理質量控制與指導中心, 中華醫學會腫瘤學分會肺癌學組,等. 非小細胞肺癌分子病理檢測臨床實踐指南(2021版). 中華病理學雜志, 2021, 50(4): 323-332.

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