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                血液ctDNA標本處理規范及其在肺癌分子檢測中的應用
                前言:為響應健康中國2030要求,推動全國腫瘤病理診斷能力提升、質量控制,由北京健康促進會發起并主辦的“星光生輝—腫瘤規范化病理示范活動”專題推文活動將于近期在91360智慧病理網旗下多個自媒體平臺發行舉辦?;顒右苑伟?、結直腸癌、乳腺癌、胃癌四大惡性腫瘤為重點開展,以基層腫瘤診療規范化建設、腫瘤診斷標準規范流程等內容進行專家專訪或解讀為主,通過詳細的學術分享以促進醫院腫瘤診療規范化及病理醫生腫瘤診斷能力提升。
                在臨床實踐中,多數NSCLC患者初診往往已到中晚期,難以手術;部分NSCLC患者腫瘤還伴有異質性,使得常規FFPE樣本的基因檢測結果與靶向治療效果不符。此時采用肺癌患者血液ctDNA進行分子檢測可有助于肺癌患者的靶向治療。本文主要就血液中ctDNA標本的處理以及其在肺癌分子檢測中的應用等相關內容進行介紹。
                  近年來,隨著分子病理診斷技術及靶向藥物研發不斷進步,精準醫學與個性化用藥的理念在腫瘤治療中已取得長足發展。其中,非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)的分子靶向治療是腫瘤精準診療最為普及的臨床實踐。臨床醫生基于患者驅動基因的差異,如表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR,45%-55%)、KRAS(8%-10%)、間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK,5%-10%)等【1, 2】。針對上述突變給予不同靶向治療藥物,顯著延長患者的生存時間,提高生活質量。
                  在常規診療過程中,經手術治療的肺癌患者,手術切除樣本送病理后,石蠟切片(FFPE)樣本進一步開展分子檢測,包括PCR、第二代測序(NGS)等,評估腫瘤突變類型是否適合靶向治療已成為當前NSCLC診療共識【2】。但是在臨床實踐中,多數NSCLC患者初診往往已到中晚期,難以手術,甚至部分患者穿刺活檢也無法耐受,導致腫瘤組織樣本難以獲取開展正常途徑的分子檢測。此外,部分NSCLC患者腫瘤還伴隨有異質性,使得常規FFPE樣本的基因檢測結果與靶向治療效果不符【3】?;谏鲜龇N種原因,我國NSCLC患者分子檢測率偏低。因此,探尋作為其補充或替代的其他生物標本進行EGFR基因檢測具有重要臨床意義,也有助于提高臨床患者的總體EGFR基因受檢率。
                  近年來,腫瘤患者液體活檢技術飛速發展,包括外周血中循環游離DNA(cfDNA)及循環腫瘤DNA(ctDNA)檢測應用于腫瘤分子檢測已有大量報道。研究表明,大部分晚期NSCLC患者的血液中均能檢出循環游離DNA(cfDNA)及循環腫瘤DNA(ctDNA)【3-5】;將外周血ctDNA樣本應用于EGFR基因突變檢測結果能夠有效預示EGFR靶向抑制劑療效【6,7】。因此,當腫瘤組織難以獲取時,如晚期NSCLC患者無法行手術及穿刺時即可開展血液ctDNA檢測,作為腫瘤組織檢測的重要補充。且在部分情況下,如腫瘤術后復查、腫瘤復發或靶向治療發生耐藥時復檢腫瘤分子特征具有不可代替性。2015年《NSCLC血液EGFR基因突變檢測中國專家共識》在推薦所有NSCLC患者均應接受腫瘤組織EGFR突變檢測的基礎上,補充了如果腫瘤標本不可評估,則可使用從血液(血漿)標本中獲得的ctDNA進行評估,盡可能明確最可能從EGFR靶向藥物治療中受益的NSCLC患者【8】。
                1.ctDNA特征簡介
                  ctDNA 通常是指由腫瘤細胞主動分泌或在腫瘤細胞凋亡或壞死過程中釋放入循環系統中的 DNA 片段,長度 132~145 bp,半衰期較短(一般<2 h)。因此,ctDNA有可能攜帶來源于腫瘤細胞相關的遺傳學特征,如基因突變、甲基化、擴增或重排等,可作為腫瘤篩查、伴隨診斷、治療療效評估及預后風險分層的重要指標【9】。

                  但在腫瘤患者血液中,ctDNA 水平一般呈動態變化,且受多種因素影響:1)在腫瘤負荷較輕、特定部位(如顱內腫瘤)和特定組織學(如膠質瘤),以及增殖、凋亡和/或血管化水平較低的腫瘤患者中,ctDNA水平通常較低【9】。2)大量其他來源的 DNA 干擾。如其他正常細胞或白細胞來源的DNA,與ctDNA一起被稱為游離 DNA(cell free DNA,cfDNA)。3)多種生理和病理因素,如懷孕、劇烈運動、外傷、炎癥、心肌梗死、自身免疫性疾病和急性中風等也會影響ctDNA的釋放【9】。4)克隆性造血細胞產生的cfDNA攜帶的基因突變信息可能會干擾ctDNA檢測結果【9】。除此以外,還有多種因素導致ctDNA攜帶信息受到影響,其波動較大,在臨床檢測和報告解讀中應尤為注意。
                  2.血液ctDNA標本處理規范
                  目前國內已開展的ctDNA NGS檢測實驗室中,質控回顧分析結果仍存在較多問題。因此,為推動ctDNA樣本分子檢測質量提高,2022年《ctDNA高通量測序臨床實踐專家共識》針對上述問題提出如下幾點關鍵要點【10】
                  2.1 實驗室要求及體系構建
                  開展ctDNA樣本的分子檢測實驗室應完全滿足腫瘤二代測序實驗室的總體設計與要求,如“各區獨立,注意風向,因地制宜,方便工作”原則,配備相應實驗儀器及分區實驗場地。所有試劑耗材應優先選擇獲得NMPA三類醫療器械證的檢測試劑和配套耗材,或至少選擇經過性能確認的臨床實驗室自建項目(laboratory developed test,LDT)試劑替代。同時包括常規質控、試劑質檢等體系驗證。
                  2.2 樣本收集、處理原則
                  全血中血漿和血清均能分離出ctDNA,但通過和相匹配的血清樣本比較后發現,血漿中ctDNA有更高的檢出率。因此,建議按照指南方法,采用國家藥監部門批準的、大容量血漿游離DNA分離試劑盒來提取游離DNA。至少采集10 mL全血并進一步分離血漿【ctDNA高通量測序臨床實踐專家共識】。具體方法包括:
                  1)使用含有游離DNA保護劑及防細胞裂解保護劑的專用常溫采血管采集全血,采集后輕搖混勻,常溫(6-30℃)放置不超過5-7天;以足夠的離心力將全血充分離心兩次,分離出不含細胞成分的血漿,放置于-70℃凍存直至DNA抽提,或直接進入DNA抽提步驟。
                  2)用常規EDTA抗凝管(嚴禁使用肝素抗凝管)采集全血后,兩小時內以足夠的離心力將全血充分低溫離心兩次,分離出不含細胞成分的血漿,放置于-70℃凍存直至DNA抽提,或直接進入DNA抽提步驟??紤]到臨床實踐的方便性,建議盡量采用第一種方案采集10 mL全血。此外應注意,血漿分離過程中應注意避免吸入白細胞。
                  2.3 ctDNA在非小細胞肺癌中的應用
                  2.3.1  指導臨床靶向用藥及耐藥監測  根據NCCN指南,對于具有相應基因突變的NSCLC患者可以采用相應的靶向藥物治療,如EGFR 21號外顯子L858點突變和19號外顯子缺失突變可以選擇吉非替尼、奧希替尼等藥物治療。晚期NSCLC患者往往難以獲得組織標本,此時可以應用ctDNA檢測這些肺癌相關驅動基因的改變,從而指導臨床靶向治療。另外,ctDNA檢測還可以有效地監測到治療過程中出現的耐藥基因,如EGFR-T790M,這樣有利于臨床醫生及時調整治療策略【11】。
                  2.3.2 肺癌的輔助診斷  采用二代測序方法檢測ctDNA比ARMS法對于輔助診斷肺癌具有明顯的優勢。有研究通過CAPP-Seq方法檢測13例肺癌和5例健康人外周血中的ctDNA,研究結果發現ctDNA對診斷II-IV期肺癌與I期肺癌的敏感性分別為100%和50%,特異性為96%,對于所有肺癌患者診斷的AUC值為0.89,該研究表明基于高通量的二代測序技術檢測ctDNA中的腫瘤基因變異可用于診斷NSCLC【11】。
                  2.3.3 肺癌患者的預后評估  ctDNA檢測是監測腫瘤基因組實時變化的一種有效手段,可以用于肺癌患者的預后評估。一項研究發現接受一線靶向治療的晚期非小細胞肺癌患者進行ctDNA檢測,發現具有KRAS基因突變的肺癌患者預后相對較差【12】。
                  2.3.4  預測早期NSCLC治療后的早期復發  一項研究分析了88例NSCLC患者的363個系列血漿樣本,采用外顯子組測序鑒定體細胞突變,并使用患者特異性RaDaR分析了血漿。研究結果發現分別有24%、77%和87%的I、II和III期患者在治療前檢測到ctDNA,其中18/28(64.3%)的原發腫瘤臨床復發患者在治療后檢測到ctDNA,這項研究表明使用敏感的檢測方法對早期NSCLC患者進行初始治療后的ctDNA檢測有可能識別早期復發患者【13】。
                  2.3.4 檢測微小/分子殘留病灶【14】在早期NSCLC根治術后的輔助治療中,微小/分子殘留病灶(MRD)的檢測結果指導術后輔助治療可產生顯著的臨床相關性。國外一項研究采用CAPP-seqjiance ctDNA,在MRD出現36個月后,可檢測到ctDNA的患者100%進展,而未檢測到ctDNA的患者93%疾病無進展,MRD未檢出ctDNA的患者遠期生存率明顯高于檢測到ctDNA的患者。該研究表明治療后ctDNA由陽性轉陰性,預示手術或輔助治療后可以清除MRD,從而改變其疾病進展和生存,而ctDNA繼續呈陽性或由陰轉陽,可能預示存在MRD,提示需要改變治療方案。
                小結
                  NSCLC發病率逐年升高,其中腫瘤基因突變鑒定診斷對NSCLC患者預后及靶向用藥具有重要意義。隨著檢測技術的發展,在保證現有檢測特異性和預測準確性的基礎上,不斷提高血液EGFR檢測的靈敏度,將有助于整體上提高我國肺癌患者的EGFR基因受檢率,從而使更多的患者接受精準的靶向治療。
                  參考文獻
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