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                肺癌小標本探討——穿刺標本病理規范化處理流程
                前言:為響應健康中國2030要求,推動全國腫瘤病理診斷能力提升、質量控制,由北京健康促進會發起并主辦的“星光生輝—腫瘤規范化病理示范活動”專題推文活動將于近期在91360智慧病理網旗下多個自媒體平臺發行舉辦?;顒右苑伟?、結直腸癌、乳腺癌、胃癌四大惡性腫瘤為重點開展,以基層腫瘤診療規范化建設、腫瘤診斷標準規范流程等內容進行專家專訪或解讀為主,通過詳細的學術分享以促進醫院腫瘤診療規范化及病理醫生腫瘤診斷能力提升。
                肺癌是目前世界范圍內死亡率最高的惡性腫瘤,其中多數以非小細胞肺癌( non-small cell lung cancer,NSCLC) 為主。對于一些影像學高度懷疑癌的結節,可取小活檢標本進行明確診斷,同時可進行分子診斷指導治療和預后。肺癌小標本在使用過程中要注意節約,計劃使用,最好一次切取,同時完成病理診斷( 含免疫組化)和分子病理檢測。為了滿足患者極少的標本,特別是無法再進行手術和穿刺的患者,既要進行HE 染色,免疫組織化學染色,還有足夠量來進行分子病理檢測,減少穿刺標本的漏診率和誤診率,對其穿刺標本進行規范化管理非常重要。
                  肺癌是目前世界范圍內死亡率最高的惡性腫瘤,其中非小細胞肺癌( non-small cell lung cancer,NSCLC) 約占其總數的85%【1】。對于一些影像學高度懷疑癌的結節,在CT 引導下通過不同方式取材活檢行病理學檢查,對肺內結節的明確診斷及后續治療起到了重要的作用,其準確性高,可操作性強。而在實際工作中,由于患者穿刺組織少,極易造成漏診和誤診,特別是經過常規制片HE 染色,免疫組織化學檢查等鑒別診斷后,剩余組織較少,很難再進行進一步分子病理檢測,嚴重影響患者的治療。因此規范化處理肺癌組織活檢小標本在臨床病理工作中有著很重要的作用【2】。
                圖1.肺癌小標本檢測規范化流程【3】
                  組織活檢小標本的取材方式一般為:1.外科手術:縱隔鏡檢查,淋巴結或淺表腫物切除。胸腔鏡活檢或切除,開胸活檢等;2.活檢:經支氣管鏡活檢,經皮肺穿刺活檢,轉移部位穿刺活檢,胸膜活檢等。其中應用最廣泛的是經支氣管鏡活檢和經皮穿刺活檢;3.細胞學:TBNA或EBUS-TBNA,經支氣管刷檢,支氣管肺泡灌洗液,體腔積液細胞學等。這些方法中,可獲取的組織或細胞數目依次減少,因此需選取合適的方法對可疑病灶進行取材。不同組織活檢小標本取材方式不同并有其優缺點:1.手術標本:可獲得充分的組織,診斷準確,可同時切除原發灶,但同時創傷大,需肺葉切除,損失肺功能;2.經皮肺穿刺活檢術:適用于外周型腫物,創傷較小,但穿刺時受呼吸影響,容易咯血,取得的組織較少;3.纖維支氣管鏡檢查:適用于段支氣管及中央型病變的觀察與活檢,創傷小,但取得的組織少,未侵入氣道內的腫物難以取到,活檢后常見出血;4.骨轉移灶取樣:創傷小,可取出轉移灶碎片,可明確病理組織類型,但標本較少,需經脫鈣液處理,難以做基因檢測。目前,CSCO指南中組織活檢在臨床取材中的基本原則為:多學科聯合的方式,以最小的創傷,取足量的組織?;静呗酝扑]纖維支氣管鏡,經皮肺穿刺活檢,淋巴結活檢及體腔積液細胞學檢查等??蛇x策略推薦胸腔鏡、縱隔鏡和EBUS。
                  組織活檢小標本在處理過程中有很多需要注意的地方。一般福爾馬林固定時間越長,發生交聯的程度越高;適當的固定,保留組織形態,可以精準定位腫瘤細胞。當組織樣本不做固定時,其純化產物易于蛋白降解,形態發生破壞,但核酸片段完整,純化后效果較好,這類組織不適合做免疫組化標記和FISH等。適度的福爾馬林固定后的標本,蛋白保留,形態保留,一部分核酸被片段化,一部分核酸與蛋白質發生交聯,對分子診斷會產生一定影響,對一般的免疫組化檢測影響不大。而長時間經福爾馬林固定后的標本,核酸被嚴重片段化,核酸與蛋白質發生大量交聯,嚴重影響免疫組化、FISH、PCR和NGS等分子實驗的結果。組織活檢小標本固定的基本要求:1. 選擇合適的固定液:組織學標本需10%中性緩沖福爾馬林(即4%甲醛磷酸鹽緩沖液pH 7.2-7.4)。使用乙醇固定液 、非中性、濃度不足的福爾馬林固定液都將影響固定后的組織結構不當的固定會破壞細胞形態,降低染色質量,嚴重的延遲固定甚至造成組織自溶 。須確認10%中性緩沖福爾馬林溶液為即用型,非濃縮型,須確認10%中性緩沖福爾馬林溶液在效期內。定期更換、室溫貯存。過期、濃度不當的固定液,可能導致IHC/ISH 片狀、不正常染色。細胞學標本需采用95%乙醇、50%乙醇及液基專用固定液。2.足量的固定液。組織學標本固定液體積比為1:10以上, 不可低于1:4。固定不足會導致后續酒精固定、染色不穩定,及時固定組織離體后立即置入固定液中, 越快越好,最好在20min內固定,建議不超過一小時。充分固定,固定時間建議6-72小時,24小時為最佳?;顧z的小標本至少需要6-8h的10%中性福爾馬林固定。
                  對于后續需進行不同檢測的標本其要求不同。1.IHC、FISH石蠟樣本制備要求:組織固定需10%中性緩沖福爾馬林,組織離體后立即固定(1h內),固定液量與所浸泡組織比例足夠,固定6-72小時為宜。對于組織切片,未經染色切片室溫放置不宜超過6周。IHC檢測切片厚度3-5μm為宜。FISH檢測切片厚度4-5μm為宜。2. ARMS-PCR樣本制備要求:組織固定需10%中性緩沖福爾馬林,組織離體后立即固定(30min內),固定液量≥10倍固定標本體積,活檢組織標本固定6-12小時,手術切除標本固定6-48小時。保證包含足夠的腫瘤細胞,盡量剔除非腫瘤組織和細胞。組織切片推薦腫瘤細胞數量在200個以上,腫瘤細胞比例達50%。一般需切厚度5-10μm的切片,10張以滿足對腫瘤細胞數量的要求。切片時要有措施避免不同病例組織間的交叉感染。3.NGS(靶向測序)檢測樣本“質”要求:組織固定需10%中性緩沖福爾馬林?;顧z標本固定24小時,對于穿刺樣本,固定時間控制在6-24小時為佳。長時間(1周以上)浸泡在福爾馬林中的樣本DNA會被片段化,不能檢出突變。組織切片切取5張連續切片,其中1片進行HE染色,確認腫瘤細胞的含量。腫瘤細胞是否存在,是開展腫瘤個體化治療基因檢測的重要前提。4. NGS(靶向測序)檢測樣本“量”要求:組織塊要求不小于5×5×5mm,組織包于蠟塊正中央,提供至少5-8張面積約25mm2厚度3-10μm的腫瘤組織切片, 每張切片腫瘤組織的含量至少在70% 以上。過低的腫瘤組織含量,會直接影響腫瘤突變豐度,造成假陰性。穿刺石蠟標本可進行NGS檢測,目前有些技術2張石蠟切片(最低2ng DNA)即可滿足檢測需要,檢測前應由病理醫生根據腫瘤占比評估能否適用于檢測。
                  組織活檢小標本的分子檢測平臺的選擇:常規分子病理診斷技術仍然是目前主流,NGS等高通量高敏感技術已走向前臺??蛇x擇的平臺有:1.免疫化學(IHC)檢測;2. 熒光原位雜交(FISH)檢測;3. ARMS-PCR檢測;4. 核酸序列測定:包括Sanger測序、焦磷酸測序和NGS測序。NGS是目前“熱門”的分子病理檢測技術,它可以邊合成、邊測序,多位點、多基因同時檢測。同時還可以對腫瘤進行用藥指導,既可以定性檢測也可以定量檢測。在小組織標本樣本量充足的情況下,可應按指南進行相應的分子檢測?,F階段單基因檢測地位不可取代,PD-L1 IHC檢測目前面臨諸多挑戰,國內缺乏檢測標準。EGRR、KRAS、BRAF和HER2等基因突變推薦單基因檢測和NGS全外顯子組測序;FGFR2和MET的基因擴增優先推薦FISH檢測;ALK,ROS1和RET的基因重排推薦FISH和RT-PCR檢測;EGFR、MET、PD-1/PD-L1蛋白過表達優先推薦IHC和ELISA檢測。而對于PD-L1表達的免疫組化檢測結果,目前上市的5種藥物都有其不同的評分標準和FDA推薦的診斷狀態,國內目前普遍采用的是針對Pembrolizumab的22C3抗體,通常作為伴隨診斷需計數腫瘤細胞的TPS,臨床中報告的截斷值以1%和50%為界。
                  目前組織活檢小標本檢測流程的需要進一步優化。如何讓有限的樣本量既滿足診斷與鑒別診斷又要同時完成IHC、FISH、PCR及NGS檢測等全方位的病理學評價亟需規范化的管理。原則是盡可能少的使用免疫組化指標,以節省標本用于分子檢測。60-70%的NSCLC分化較好,可以通過形態學確診。30%分化較差的,可使用IHC(TTF-1和p40)輔助診斷。一次性切出病理診斷和分子檢測需要的樣本量,避免重復切片浪費標本。推薦使用表1中的免疫標記進行鑒別【4】:
                表1.NSCC鑒別診斷推薦免疫標記物
                  近些年來,ROSE在組織活檢小標本取樣在各級醫院中得以廣泛使用。ROSE可快速評定標本質量甚至是確定診斷,減少穿刺次數,縮短診斷時間。超聲內鏡引導下的經支氣管針吸活檢(EBUS-TBNA)是2002年開始研發的新技術,2007年即已被美國國家綜合癌癥網絡(NCCN)和美國胸科醫師學會(ACCP)推薦為肺癌術前淋巴結分期的重要手段,成為肺癌縱隔分期的新標準,且趨勢上有取代外科縱隔鏡的可能。EBUS-TBNA在2008年引入中國投入臨床使用。EBUS-TBNA的主要適應證為(1)肺癌患者淋巴結分期;(2)肺內腫瘤的診斷;(3)診斷不明原因的肺門和/或縱隔淋巴結腫大;(4)縱隔腫瘤的診斷。對疑診肺癌患者、縱隔和/或肺門淋巴結腫大患者、中央型腫瘤患者實施TBNA時應加用ROSE,對擬行分子病理學檢測的晚期肺腺癌患者,樣本中腫瘤細胞的數量和質量十分重要,也應加用ROSE。在ROSE應用中,病理科應協助實施ROSE,同時,經過培訓的肺科醫生可自行對 TBNA 樣本進行ROSE。
                  綜上,腫瘤患者靶向藥物推進了病理分子學的發展,正確的病理診斷和準確的分子病理診斷都依賴于合理規范地使用肺癌小標本。在日常工作中,要確保每個檢測結果的準確性、可靠性、可重復性,質量控制和質量保證是關鍵。做好日常的室間質控和室間質評,盡量嚴格地規范化使用現有肺癌小標本,標準化操作程序,共同推進病理診斷的規范化。
                參考文獻:
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                2.范松龍,季盼,龔春香,等.肺穿刺標本在分子病理檢測中的規范化管理[J].診斷病理學雜志,2020,27(11):838-848
                3.Martin Reck , Klaus F Rabe , Precision Diagnosis and Treatment for Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer, N Engl J Med. 2017 Aug 31;377(9):849-861. 
                4.Travis WD, et al. Diagnosis of lung cancer in small biopsies and cytology: implications of the 2011 International Association for the Study of Lung Cancer/American Thoracic Society/European Respiratory Society classification[J]. Arch Pathol Lab Med. 2013 ,137(5):668-84

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